显微镜下金葡菌基因组DNA提取的技巧
一、组织抽提：
1. 显微镜下取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末
2. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打
3. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆
4. 冰上孵育5分钟
5. 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管
6. 加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟
7. 离心<12,000g 4℃ 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管
8. 加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟
9. 离心<12,000g 4℃ 5分钟 弃去上清液
10. 加入1 ml 75%乙醇，震荡
11. 离心<7,500g 4℃ 5分钟 弃去上清液
12. 室温下使之变透明
13. 加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低温冰箱）
14. 走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度
二、RT反应体系（第一步）：约20分钟
RNA 抽提物
5μl
Radome 引物
2μl
RNA sin
0.5μl
1. 65℃ 15分钟
2. 立即放入冰浴
RT反应体系（第二步）：约2小时
RNA sin
0.5μl
10mM dNTP
1μl
5×RT 缓冲液
4μl
25mM MgCl2
4μl
AMV 逆转录酶
3μl
1. 37℃ 1.5小时
2. 94℃ 5-10分钟
3. 反应物保存于-20℃或进行PCR
三1、PCR反应体系：约4.5小时
25mM MgCl2
2μl
10×PCR 缓冲液
5μl
10mM dNTP
1μl
上下游引物10pmol/μl
2.5μl×2
CDNA模板
2.5μl
ddH2O
34μl
Taq酶
0.5μl
轻质石蜡油
50μl
100μl
1. 94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环
2. 94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步30个循环
3. 72℃ 10分钟
4. 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳
三2、PCR反应体系：约5小时
25mM MgCl2
3μl
10×PCR 缓冲液
5μl
10mM dNTP
1μl
上下游引物10pmol/μl
2.5μl×2
CDNA模板
5μl
ddH2O
30μl
Taq酶
1μl
轻质石蜡油
50μl
100μl
1. 94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环
2. 94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步40个循环
3. 72℃ 10分钟
4. 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳
四、电泳：约1.25小时
1. 配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml
2. 胶浓度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g胶）
3. 微波炉中火2分钟溶解胶
4. 冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）
5. 放入梳子，浇板，待凝固
6. 加8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰
7. 电泳50-80V（每㎝ 5V）
本文显微镜信息转载于http://www.xianweijing.org/显微镜百科
相关资讯：
显微镜观测的革兰氏染色为什么不能用老龄菌？
显微镜下的恐怖僵尸蚂蚁
显微镜在神经外科手术过程中使用中应该注意的细节
如何把用于显微镜观测的细胞养的更漂亮
