相差显微镜观测熟视网膜神经节细胞三维培养

提供给你一种成熟视网膜神经节细胞三维培养方法：

1大鼠培养网膜的获得 10周龄的Wistar系大鼠，乙醚麻醉后摘出完整眼球，在显微镜下依次除去角膜，巩膜和脉络膜，再除去晶体和玻璃体，分离网膜。上述操作要求动作轻巧快速准确，分离网膜时，要把玻璃体完全清除干净。切除周边网膜，取距视盘1至1.5mm处网膜，切成边长500μm的方形网膜片16片,显微镜。上述操作要求在培养液内完成，无菌操作，避免细菌污染。

.2 网膜片的培养 在0℃环境下，将配置好的胶原溶液滴于用10 mg•L-1多聚赖氨酸包被的培养孔中央，形成直径15mm的胶原溶液层。胶原溶液由以下成分组成:①用CH3COOH溶液稀释的0.3%Ⅰ型胶原(从大鼠尾巴提取)pH3.0;②10倍浓度的MEM培养液; ③每100ml含NaHCO3 2.20g和Hepes 4.77g的0.05N NaOH。①: ②: ③=8:1:1。将网膜片的神经纤维层向下浸入胶原溶液层中，每孔4片。37℃水浴5min。液态胶原凝固成盘状凝胶，网膜片固定在其中（附图）。培养孔中加入培养液，置于5%CO2、37℃恒温箱中。隔日换培养液。培养液成分如下: 不含血清的MEM，2.7 g•L-1的葡萄糖，5 mg•L-1的胰岛素，16.1 mg•L-1的肉毒碱，792 mg•L-1的小牛血清白蛋白,金相显微镜价格，5.2μg•L-1的Na2SeO3，3.7g•L-1的NaHCO3，3.6 g•L-1的Hepes。用相差显微镜观察生长情况。