原生质体电子显微镜观察鉴别实验技术的应用
在溶壁酶的作用下，将真菌的细胞壁溶解，不同的真菌、同一种真
菌不同的菌态以及同一菌丝体不同部位的细胞的细胞壁的成分、厚
度皆不相同。相对薄弱的部位较先解体，形成孔洞，释放原生质体
。当溶壁酶开始对细胞壁发生作用时，细胞膜上的释别信号就对这
一外部作用作出了精确的反应，质膜收缩，发生质壁分离现象，并
形成具有再生能力的原生质体。其目的就是分离到数量多、生活能
力强的原生质体。原生质体分离技术包括较佳分离条件的选择、鉴
别方法、保藏方法等。
随真菌种类的不同，较佳分离条件的选择也不同，大体上包括
如下技术：预处理，培养基，培养温度，培养方法，菌态和菌龄，
溶壁酶的种类、浓度和配比，酶解方法，酶解温度，酶解时间，渗
透压稳定剂的种类、浓度等。
鉴别方法和技术包括：原生质体计数方法、活力鉴别技术，细
胞核染色技术，原生质体电子显微镜观察技术，细胞培养小室应用
技术，DNA分离与纯化技术，染色体DNA测定技术，荧光素标记技术
等。
保藏方法和技术包括：超低温保藏技术和低温藏油法保藏技术
。
原生质体融合的原理和技术
真菌的原生质体融合是指双亲原生质体，在化学助融合剂、电
脉冲和激光束等诱导下相互融合。根据亲本性质的不同，将原生质
体融合分为原生质体与原生质体融合、原生质体与细胞核和染色体
的融合以及原生质体对细胞器的摄取。根据诱导原生质杂交因子的
性质不同，将原生质体融合分为化学融合、物理融合和生物融合三
大类。根据融合亲本亲缘关系远近，将真菌原生质体融合分为近缘
原生质体融合和远缘原生质体融合两大类。当前真菌细胞工程学中
应用较广的原生质体融合技术为聚乙二醇(PEG)诱导的化学融合和
电脉冲诱导的电融合。
融合的机制：膜融合是一种非常重要的生物学现象，也是生物
界普遍存在的一种现象如受精、胞饮、吞噬、菌丝融合等。这一细
胞及亚细胞水平事件涉及细胞的内吞、外排及与外界交换物质、能
量等。膜的融合是原生质融合非常关键的一个步骤。随着各种诱导
因子的发现，各种膜诱导模型也随之建立，“局部脱水与膜融合”
模型更多地被人们所接受。也有人提出原生质体融合是由于膜表面
电荷诱导融合的模式。PEG诱导的原生质体融合机制有：原生质体
局部脱水，改变了质膜内外的电位差，以分子桥形式沟通两原生质
膜和改变膜的流动性，质膜蛋白质颗粒凝聚等。电脉冲诱导的原生
质体融合机制有电介质电泳、稳定的膜接触、可逆电击穿、串珠形
成等。无论是PEG诱导的融合，或者电泳冲诱导的融合，脱去细胞
膜表面的结合水都是必需的步骤。由于原生质体先发生了膜融合的
关键步骤，细胞质和细胞核融合才有可能进行。原生质体融合过程
不仅仅是一个复杂的物理化学过程，而且也是一个复杂的生命活动
过程。对于融合的机制，还有许多问题不清楚，尚待深人研究。
