荧光显微镜的物镜尽可能采用较大的数值孔径NA
标本的特点为了增强荧光显微镜的使用效果,在设置荧光标本切片
时,应具备以下特点:
载玻片应选用能透过短波紫外光的石英玻璃。厚度约为0.8—
1.2mm。过厚的玻片吸收紫外光较多,而且对暗视场聚光镜效果有
影响。载玻片应当光洁,无油迹,无划痕。
盖玻片宜采用镀膜玻璃。一般表面镀有氟化镁等若干层对不同
波长的光起不同干涉作用的物质,这样可以透过荧光而反射激发光
。反回的激发光能再次激发标本,增强荧光的能量。
标本取样不能太厚,尽量薄一些,散开要均匀,这样能使标本
得到充分、均匀的激发。尽量减少标本重叠,互相掩盖,否则因激
发不均匀,影响判断。
标本封载剂必须采用无荧光性能,无色透明的物质。通常使用
分析纯甘油缓冲液,其中甘油体积90%,磷酸盐缓冲水10%,pH值
为7.2—8.5。固定盖玻片时,可用含量1%的明胶水,盖上玻片
后,以10%的福尔马林凝固。使用油镜观察时,注意不能使用普通
的香柏油。因为香柏油在紫外光照射下有轻微荧光效应,干涉观察
。此时可在香柏油中拌入适量的荧光熄灭剂如硝基苯,减少香柏油
的荧光效应。有条件时,较好使用纯檀香油,本身无固有荧光。用
纯甘油缓冲液也可代用,但折射率略低一些,宜配用甘油浸液物镜
。
对镜头的要求
为了提高荧光图像的亮度,荧光显微镜的物镜尽可能采用较大的
数值孔径NA,同时,物镜和高倍目镜中,透镜胶合不能使用加拿大
树脂胶。因为加拿大树脂胶主要成分冷杉树脂在紫外线光激发下会
发生轻度的荧光效应,干扰观察效果。所以荧光显微镜所用镜头的
透镜胶合,一般用聚乙烯醇一类的合成胶。这种镜头在普通显微镜
均可应用。